气泡上升法测定生物活性
溶液配制：
磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠（含2H 2O ）1.79g, 磷酸氢二钠7.10g, 叠氮化钠0.20g ，吐温－80 0.1g，加水至1000mL 。
人凝血酶溶液：取人凝血酶，加磷酸盐缓冲液制成每1mL 中含33U 的溶液。
人纤维蛋白原溶液：取人纤维蛋白原，加磷酸盐缓冲液制成每1mL 含可凝蛋白2mg 的溶液。 人纤维蛋白溶酶原溶液：取人血纤维蛋白溶酶原，加磷酸盐缓冲液制成每1mL 含1mg 的溶液。
混合溶液：临用前取等体积的标准品溶液或供试品溶液与人凝血酶溶液，混匀，置冰浴中。 标准品溶液的制备：取t-pa 国际标准品用磷酸盐缓冲液制成浓度分别为每1mL 中含850，425，213，107，54，27IU 的溶液。
供试品溶液的制备：取待标定的样品同标准溶液配制。
测定法：取试管6支，加人血纤维蛋白溶酶原溶液20 ul 与人纤维蛋白溶液1ml ，混匀，置冰浴中，依次加不同单位的混合溶液200u l ，立即摇匀，并置（37±0.5℃）水浴中，分别计时，反应系统应在30秒内凝结，当凝块内所有气泡上升至表面时作为反应终点，计时，以rht-pa 浓度的对数作为横坐标，以反应时间（秒）的对数作为纵坐标，进行线性回归，其相关系数不得低于-0.990。同法测定供试品溶液。
备注：组织型纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)和重组型纤维蛋白溶酶原激活物(rt-PA)
带有表达质粒pBV220/PAI-1的大肠杆菌中，在菌体密度为Ａ600nm=0.3--0.4 时诱导，表达重组PAI-1(rPAI-1)的效率最高。在诱导后的6h 以内，rPAI-1的百分含量持续升高。rPAI-1经分离纯化并用盐酸胍激活后，能够与t-PA 及u-PA 反应，用SDS -PAGE 和纤维蛋白自显影方法可以检测出它们所形成的复合物。
比活测定
(1) 试剂
牛纤维蛋白原溶液 取牛纤维蛋白原，加巴比妥一氯化钠缓冲液（pH 7.8）制成每1ml 中含6.67mg 可凝结蛋白的溶液。
牛凝血酶溶液 取牛凝血酶，加巴比妥－氯化钠缓冲液（pH 7.8）制成每1ml 中含6.0 单位的溶液。
牛纤维蛋白溶酶原溶液 取牛纤维蛋白溶液酶原，加三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH9.0 ）制成每1ml 中含1 ～1.4 酪蛋白单位的溶液（如溶液浑浊，离心，取上清液备用）。
混合溶液 临用前取等容积的牛凝血酶溶液和牛纤维蛋白溶酶原溶液，混匀。
(2) 标准品溶液的制备 取尿激酶标准品，加巴比妥－氯化钠缓冲液(pH 7.8)制成每1ml 中含60单位的溶液。
(3) 供试品溶液的制备 取本品适量，用巴比妥－氯化钠缓冲液(pH 7.8)溶解、混匀，并稀释成与标准品溶液相同的浓度。
(4) 测定法 取试管4 支，各加牛纤维蛋白原溶液0.3ml ，置37℃±0.5℃水浴中，分别加入巴比妥－氯化钠缓冲液(pH7.8)0.9ml、0.8ml 、0.7ml 、0.6ml ，依次加标准品溶液0.1ml 、0.2ml 、0.3ml 、0.4ml ，再分别加混合溶液0.4ml ，立即摇
匀，分别计时。反应系统应在30～40秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，记时。以尿激酶的浓度为横坐标，以反应终点时间与入水浴时间的差值为纵座标，在双对数纸上绘制标准曲线，应呈直线。供试品按上法测定，在标准曲线上求得效价(单位) 。标准品和供试品各作二次，所得的直线亦应平行，否则应重复试验。
蛋白质含量 取本品约10mg ，精密称定，照氮测定法（附录Ⅶ D 第二法）测定，将结果乘以6.25，即得供试品中蛋白含量，并计算每1mg 供试品中的蛋白量（mg ）。
比活 按下式计算比活。
每1mg 供试品的效价(单位)
比活＝──────────────
每1mg 供试品中蛋白量（mg ）
纤维蛋白块溶解时间法（体外凝块裂解气泡上升法）
此法简称CLT 法。纤溶酶、tPA 、UK 等溶血栓物质都以此方法来测定活性。测定NK 活性的方法就是根据以上各种方法稍加变动而建立的［9］。
0℃下，在小试管中依次加入凝血酶、硼酸生理盐水缓冲溶液、NK 溶液和纤维蛋白原，强烈搅拌，置于37℃恒温水浴。从纤维蛋白形成开始计时，随着反应液混浊，有气泡上升到液面，到气泡冒出停止时，作为纤维蛋白溶解时间(CLT)。 同样以标准NK 或UK 或纤溶酶作为标准品，以CLT 对NK 浓度的对数作图，发现在10～70μg 范围内有很好的线性关系。
比较于平板法，CLT 法迅速快捷，有较大的分辨率，且更适于粗酶的活性测定。但随着灵敏度的提高，溶解时间的判定也更加困难。除非有新型、方便的计时装置，否则同时测定多个样品是比较困难的。简称CLT 法
纳豆激酶的测定方法有五种：纤维蛋白平板法、纤维蛋白块溶解时间法、四肽底物法、血清板法、酶联免疫吸附法。
纤维蛋白平板法：该法参照Astrup(1952)的方法，并进行了一定的改进。将纤维蛋白源溶液、凝血酶溶液按一定比例倒入无菌平皿中，小心振荡摇匀，室温凝固制成平板。在平板上分别点样纳豆激酶、尿激酶，37℃孵育18h 后，测量纳豆激酶相对于尿激酶的活性单位。本法最常用，但易受孵育时间影响。
纤维蛋白块溶解时间法：0℃下，将凝血酶、硼酸生理盐水缓冲液、纤维蛋白原及纳豆激酶溶液加入试管中，强烈搅拌，置于37℃恒温水浴中，从纤维蛋白形成起开始计时，至气泡冒出停止时为止，所用时间即为纤维蛋白溶解时间。该方法迅捷，适于粗酶的活性测定，但精度不够，且不适合多个样品的同时测定。 四肽底物法：在四肽底物Suc －Ala －Ala －Pro －Phe －PNA 溶液中加入纳豆激酶酶液，37℃水浴中孵育1min ，测定单位时间内410nm 处光吸收的变化。1min 水解该四肽底物生成1μL硝基苯胺的纳豆激酶量为1u 。该方法简便、迅速，但是所测得的蛋白酶活性不能完全表示为纤溶活性。
血清板法：将血清板制成微型纤维平板，然后在每个孔内加入不同浓度的标准纳豆激酶，反应开始后4h 内，每30min 测定一次OD655，作出吸光度的减少同纳豆激酶浓度的线性关系。这是一种改进的纤维平板法，可同时测多个样品，简便、快捷、成本低。
酶联免疫吸附法(ELISA)：将纳豆激酶的单克隆抗体吸附在微孔板上，BSA －PBS 冲洗并封堵未被吸附的部位，加入纳豆激酶，与单克隆抗体结合，孵育2h 后，再加入连有过氧化氢酶的多克隆抗体与两者结合。然后加入新配制的底物，孵育10min ，再加入1mol/LH2SO4，测定490nm 下的光吸收值。该方法特异性强，灵敏度高达0.1mg/mL，既可测量纳豆激酶的量，又可测定纳豆激酶的纤溶活性，但操作复杂、成本高。
表达蛋白的生物学活性的检测
一、MTT 比色法检测细胞活性
（一）原理
活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT 形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT 比色法进行。
（二）试剂准备
1、青链霉素溶液（100X ）：青霉素100万U ，链霉素100万U ，溶于100mlddH 2O 中, 抽滤除菌。
2、L15基础培养基：1000mlL15培养基，加2g 碳酸氢钠，10ml 100X青链霉素，5mlHEPES 。
3、MTT 液：5mg/ml溶于L15基础培养基。
4、SDS 处理液：20gSDS ，50μl 二甲基甲酰胺，加双蒸水50ml 溶解。
5、L-多聚赖氨酸：50μg 溶于1ml 双蒸水中。
6、L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。
（三）操作步骤（以背根神经节细胞培养为例）
1、无菌条件下取新生一天的SD 大鼠背根神经节（DRG ）。
2、镜下去除神经根和外膜，放入1ml 0.1%胶原酶中37℃消化30min ，每5min 摇匀一次。
3、洗去胶原酶，吹打分散后，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔含100μl 无血清L15培养基，细胞约800个。
4、实验组分别加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。
5、37℃ 5%CO2培养48hr 后，每孔加入10μl MTT，37℃ 5%CO2孵育4hr 。
6、加入100μl 20%的SDS 处理液，37℃孵育20hr 。
7、用EL ×800微孔酶标仪测定OD 570值，数据分析。
二、DRG 无血清培养检测促神经生长作用
（一）操作步骤：
1、无菌条件下取新生一天的SD 大鼠DRG 。
2、镜下去除神经根和外膜，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔1个DRG 。
3、待DRG 贴壁后加入100μl 无血清L15基础培养基，实验组加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积的溶解表达蛋白的溶剂。 4、37℃ 5%CO2培养，每天在Olympus 倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并进行测量，其数据作统计分析。
二、注意事项
1、MTT 有毒，注意防护。
2、单个DRG 贴壁实验操作难度较大，需仔细耐心。
气泡上升法测定生物活性
溶液配制：
磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠（含2H 2O ）1.79g, 磷酸氢二钠7.10g, 叠氮化钠0.20g ，吐温－80 0.1g，加水至1000mL 。
人凝血酶溶液：取人凝血酶，加磷酸盐缓冲液制成每1mL 中含33U 的溶液。
人纤维蛋白原溶液：取人纤维蛋白原，加磷酸盐缓冲液制成每1mL 含可凝蛋白2mg 的溶液。 人纤维蛋白溶酶原溶液：取人血纤维蛋白溶酶原，加磷酸盐缓冲液制成每1mL 含1mg 的溶液。
混合溶液：临用前取等体积的标准品溶液或供试品溶液与人凝血酶溶液，混匀，置冰浴中。 标准品溶液的制备：取t-pa 国际标准品用磷酸盐缓冲液制成浓度分别为每1mL 中含850，425，213，107，54，27IU 的溶液。
供试品溶液的制备：取待标定的样品同标准溶液配制。
测定法：取试管6支，加人血纤维蛋白溶酶原溶液20 ul 与人纤维蛋白溶液1ml ，混匀，置冰浴中，依次加不同单位的混合溶液200u l ，立即摇匀，并置（37±0.5℃）水浴中，分别计时，反应系统应在30秒内凝结，当凝块内所有气泡上升至表面时作为反应终点，计时，以rht-pa 浓度的对数作为横坐标，以反应时间（秒）的对数作为纵坐标，进行线性回归，其相关系数不得低于-0.990。同法测定供试品溶液。
备注：组织型纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)和重组型纤维蛋白溶酶原激活物(rt-PA)
带有表达质粒pBV220/PAI-1的大肠杆菌中，在菌体密度为Ａ600nm=0.3--0.4 时诱导，表达重组PAI-1(rPAI-1)的效率最高。在诱导后的6h 以内，rPAI-1的百分含量持续升高。rPAI-1经分离纯化并用盐酸胍激活后，能够与t-PA 及u-PA 反应，用SDS -PAGE 和纤维蛋白自显影方法可以检测出它们所形成的复合物。
比活测定
(1) 试剂
牛纤维蛋白原溶液 取牛纤维蛋白原，加巴比妥一氯化钠缓冲液（pH 7.8）制成每1ml 中含6.67mg 可凝结蛋白的溶液。
牛凝血酶溶液 取牛凝血酶，加巴比妥－氯化钠缓冲液（pH 7.8）制成每1ml 中含6.0 单位的溶液。
牛纤维蛋白溶酶原溶液 取牛纤维蛋白溶液酶原，加三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH9.0 ）制成每1ml 中含1 ～1.4 酪蛋白单位的溶液（如溶液浑浊，离心，取上清液备用）。
混合溶液 临用前取等容积的牛凝血酶溶液和牛纤维蛋白溶酶原溶液，混匀。
(2) 标准品溶液的制备 取尿激酶标准品，加巴比妥－氯化钠缓冲液(pH 7.8)制成每1ml 中含60单位的溶液。
(3) 供试品溶液的制备 取本品适量，用巴比妥－氯化钠缓冲液(pH 7.8)溶解、混匀，并稀释成与标准品溶液相同的浓度。
(4) 测定法 取试管4 支，各加牛纤维蛋白原溶液0.3ml ，置37℃±0.5℃水浴中，分别加入巴比妥－氯化钠缓冲液(pH7.8)0.9ml、0.8ml 、0.7ml 、0.6ml ，依次加标准品溶液0.1ml 、0.2ml 、0.3ml 、0.4ml ，再分别加混合溶液0.4ml ，立即摇
匀，分别计时。反应系统应在30～40秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，记时。以尿激酶的浓度为横坐标，以反应终点时间与入水浴时间的差值为纵座标，在双对数纸上绘制标准曲线，应呈直线。供试品按上法测定，在标准曲线上求得效价(单位) 。标准品和供试品各作二次，所得的直线亦应平行，否则应重复试验。
蛋白质含量 取本品约10mg ，精密称定，照氮测定法（附录Ⅶ D 第二法）测定，将结果乘以6.25，即得供试品中蛋白含量，并计算每1mg 供试品中的蛋白量（mg ）。
比活 按下式计算比活。
每1mg 供试品的效价(单位)
比活＝──────────────
每1mg 供试品中蛋白量（mg ）
纤维蛋白块溶解时间法（体外凝块裂解气泡上升法）
此法简称CLT 法。纤溶酶、tPA 、UK 等溶血栓物质都以此方法来测定活性。测定NK 活性的方法就是根据以上各种方法稍加变动而建立的［9］。
0℃下，在小试管中依次加入凝血酶、硼酸生理盐水缓冲溶液、NK 溶液和纤维蛋白原，强烈搅拌，置于37℃恒温水浴。从纤维蛋白形成开始计时，随着反应液混浊，有气泡上升到液面，到气泡冒出停止时，作为纤维蛋白溶解时间(CLT)。 同样以标准NK 或UK 或纤溶酶作为标准品，以CLT 对NK 浓度的对数作图，发现在10～70μg 范围内有很好的线性关系。
比较于平板法，CLT 法迅速快捷，有较大的分辨率，且更适于粗酶的活性测定。但随着灵敏度的提高，溶解时间的判定也更加困难。除非有新型、方便的计时装置，否则同时测定多个样品是比较困难的。简称CLT 法
纳豆激酶的测定方法有五种：纤维蛋白平板法、纤维蛋白块溶解时间法、四肽底物法、血清板法、酶联免疫吸附法。
纤维蛋白平板法：该法参照Astrup(1952)的方法，并进行了一定的改进。将纤维蛋白源溶液、凝血酶溶液按一定比例倒入无菌平皿中，小心振荡摇匀，室温凝固制成平板。在平板上分别点样纳豆激酶、尿激酶，37℃孵育18h 后，测量纳豆激酶相对于尿激酶的活性单位。本法最常用，但易受孵育时间影响。
纤维蛋白块溶解时间法：0℃下，将凝血酶、硼酸生理盐水缓冲液、纤维蛋白原及纳豆激酶溶液加入试管中，强烈搅拌，置于37℃恒温水浴中，从纤维蛋白形成起开始计时，至气泡冒出停止时为止，所用时间即为纤维蛋白溶解时间。该方法迅捷，适于粗酶的活性测定，但精度不够，且不适合多个样品的同时测定。 四肽底物法：在四肽底物Suc －Ala －Ala －Pro －Phe －PNA 溶液中加入纳豆激酶酶液，37℃水浴中孵育1min ，测定单位时间内410nm 处光吸收的变化。1min 水解该四肽底物生成1μL硝基苯胺的纳豆激酶量为1u 。该方法简便、迅速，但是所测得的蛋白酶活性不能完全表示为纤溶活性。
血清板法：将血清板制成微型纤维平板，然后在每个孔内加入不同浓度的标准纳豆激酶，反应开始后4h 内，每30min 测定一次OD655，作出吸光度的减少同纳豆激酶浓度的线性关系。这是一种改进的纤维平板法，可同时测多个样品，简便、快捷、成本低。
酶联免疫吸附法(ELISA)：将纳豆激酶的单克隆抗体吸附在微孔板上，BSA －PBS 冲洗并封堵未被吸附的部位，加入纳豆激酶，与单克隆抗体结合，孵育2h 后，再加入连有过氧化氢酶的多克隆抗体与两者结合。然后加入新配制的底物，孵育10min ，再加入1mol/LH2SO4，测定490nm 下的光吸收值。该方法特异性强，灵敏度高达0.1mg/mL，既可测量纳豆激酶的量，又可测定纳豆激酶的纤溶活性，但操作复杂、成本高。
表达蛋白的生物学活性的检测
一、MTT 比色法检测细胞活性
（一）原理
活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT 形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT 比色法进行。
（二）试剂准备
1、青链霉素溶液（100X ）：青霉素100万U ，链霉素100万U ，溶于100mlddH 2O 中, 抽滤除菌。
2、L15基础培养基：1000mlL15培养基，加2g 碳酸氢钠，10ml 100X青链霉素，5mlHEPES 。
3、MTT 液：5mg/ml溶于L15基础培养基。
4、SDS 处理液：20gSDS ，50μl 二甲基甲酰胺，加双蒸水50ml 溶解。
5、L-多聚赖氨酸：50μg 溶于1ml 双蒸水中。
6、L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。
（三）操作步骤（以背根神经节细胞培养为例）
1、无菌条件下取新生一天的SD 大鼠背根神经节（DRG ）。
2、镜下去除神经根和外膜，放入1ml 0.1%胶原酶中37℃消化30min ，每5min 摇匀一次。
3、洗去胶原酶，吹打分散后，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔含100μl 无血清L15培养基，细胞约800个。
4、实验组分别加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。
5、37℃ 5%CO2培养48hr 后，每孔加入10μl MTT，37℃ 5%CO2孵育4hr 。
6、加入100μl 20%的SDS 处理液，37℃孵育20hr 。
7、用EL ×800微孔酶标仪测定OD 570值，数据分析。
二、DRG 无血清培养检测促神经生长作用
（一）操作步骤：
1、无菌条件下取新生一天的SD 大鼠DRG 。
2、镜下去除神经根和外膜，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔1个DRG 。
3、待DRG 贴壁后加入100μl 无血清L15基础培养基，实验组加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积的溶解表达蛋白的溶剂。 4、37℃ 5%CO2培养，每天在Olympus 倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并进行测量，其数据作统计分析。
二、注意事项
1、MTT 有毒，注意防护。
2、单个DRG 贴壁实验操作难度较大，需仔细耐心。