一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法
1 材料与方法
1.1 动物
2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。
1.2 试剂
D-hank's液；
消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli
done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；
消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；
基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；
小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；
培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。
1.3 鼠肝组织块培养
1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。
2）肝组织用4℃ D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；
3）将肝组织切为约1mm3小块， 再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，
4）加入消化 液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。
5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。
1.4 鼠肝细胞单层培养
动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃ 50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。 或者：
1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。
2）肝组织用4℃ D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；
3）将肝组织切为约1mm3小块， 再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，
4）加入消化 液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离；
5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用；
6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块；
7）再次离心5min，弃上清；
8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清；
9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数；
10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。
1.5 肝细胞形态观察及其功能测定
原代培养前3 d尽量不晃动培养瓶，以后每天观察
细胞生长情况，每次换液前收集培养上清放－20℃保存，送本院检验科测定白蛋白含量。
1.6 电镜检测
待细胞生长成单层后倾去培养液刮取单层细胞加入25 ml/L戊二醛固定后按常规 方法制片，电镜(Opton EM10C,德国)观察细胞结构。
2 结果
2.1 细胞生长情况观察
原代组织块培养一般3 d后组织块周围有生长晕出现，且逐渐向周围扩展，单层细胞3 d后已贴壁生长。光镜下可见培养的肝细胞呈三角形、圆形或类圆形，排列整齐，细胞界限清晰，胞浆丰富透亮。细胞核有单核、双核，呈圆形或椭圆形，核仁清晰可见。
一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法
1 材料与方法
1.1 动物
2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。
1.2 试剂
D-hank's液；
消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli
done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；
消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；
基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；
小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；
培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。
1.3 鼠肝组织块培养
1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。
2）肝组织用4℃ D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；
3）将肝组织切为约1mm3小块， 再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，
4）加入消化 液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。
5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。
1.4 鼠肝细胞单层培养
动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃ 50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。 或者：
1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。
2）肝组织用4℃ D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；
3）将肝组织切为约1mm3小块， 再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，
4）加入消化 液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离；
5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用；
6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块；
7）再次离心5min，弃上清；
8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清；
9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数；
10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。
1.5 肝细胞形态观察及其功能测定
原代培养前3 d尽量不晃动培养瓶，以后每天观察
细胞生长情况，每次换液前收集培养上清放－20℃保存，送本院检验科测定白蛋白含量。
1.6 电镜检测
待细胞生长成单层后倾去培养液刮取单层细胞加入25 ml/L戊二醛固定后按常规 方法制片，电镜(Opton EM10C,德国)观察细胞结构。
2 结果
2.1 细胞生长情况观察
原代组织块培养一般3 d后组织块周围有生长晕出现，且逐渐向周围扩展，单层细胞3 d后已贴壁生长。光镜下可见培养的肝细胞呈三角形、圆形或类圆形，排列整齐，细胞界限清晰，胞浆丰富透亮。细胞核有单核、双核，呈圆形或椭圆形，核仁清晰可见。