水稻分子标记辅助育种研究进展

（）：黑龙江农业科学２０１２２１４２～１４５

ＨｅｉｌｏｎｉａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　ｇｊｇｇ水稻分子标记辅助育种研究进展

王彤彤

（）黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所，黑龙江哈尔滨１５００８６

摘要：为充分挖掘水稻分子标记辅助育种的潜质，分析了分子辅助育种较常规育种方法的优点，常用的分子辅助育种技术（及优点和不足，同时阐述了通过分子标记辅助选择育种方法培育ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、ＩＳＳＲ）品质以及抗病虫性等成果。或改良现有水稻品种的产量、

关键词：水稻；分子辅助育种；品种改良；现状

（）中图分类号：Ｓ５１１．０３５．３　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００２２７６７２０１２０２０１４２０４－－－

其稳定的产量，　　水稻作为中国粮食作物之首，

是保证国家粮食安全的重要指标之一。自改革开放以来，城市化建设的成绩是有目共睹的，然而所带来的问题也层出不穷，农业可以说是受到影响最大的，气象灾害频发、耕地面积下降、环境污染农村人口骤然减少，都成为了国家粮食安全加剧、

的隐患，所以提高单产，有效地利用有限的耕地、人力、生物等资源，实为第二次绿色革命的根本宗旨。转基因技术可以说是人类现代史的一个里程碑，然而，社会各界对其安全性始终表示怀疑，虽然欧美很多国家已经允许转基因农业产品在有效但更多国家依然保持的监管控制下商业化运营，

观望态度。如何将新型的生物技术更加有效又十分安全地应用到育种上去成为了新的课题。分子标记辅助育种（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｂｒｅｅｄ　　　－）即有这种潜质。ｉｎｇ

的误差，而且是完全不能避免的。而借助分子标是直接对基因型进行选择，不但精准记辅助手段，

而且效率高。植物大多数的农艺性状都是由多个基因联合调控的，所以单纯的常规育种在针对数量性状的选择上已经达到了瓶颈。

１．３　分子标记辅助育种不存在安全隐患

因为在整个育种过程当中完全不需要引入外源基因。与转基因育种有本质的区别。这项技术是将极大地发挥了种群内部遗传多态性的优势，种群内部优良性状整合的一个过程。

１．４　分子标记辅助育种是直接在ＤＮＡ水平上

选择差异它能够根据ＮＡ遗传变异的直接反映，　　是Ｄ

植物体的各个时期进行选择，不受环境及表达的限制，数量多，多态性高，并且遗传稳定。

２　几种常用的分子辅助技术

２．１　ＲＦＬＰ（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｍｅｎｔＬｅｎｔｈＰｏｌ　　　－ｇｇｙ

ｍｏｒｈｉｓｍ）ｐＦＬＰ是Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等于１９８０年提出的分子　　Ｒ

生物学最早的遗传标记技术。它指的是基因型之间限制性片断长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或者点突变引

［］起的。１９９４年沈革志等１利用２８个ＲＦＬＰ标记

１　分子标记辅助育种技术的四大优点

１．１　针对质量性状的选择

常规杂交育种通过对其表现型常年多次重复的观察是可以获得其纯合植株的。但周期一般要七八年甚至是十多年。在常规育种的基础上借助分子技术的辅助手段可以将质量性状准确地定位，大大地降低了回交的次数，也缩减了所需要的年限。

１．２　针对数量性状的选择

常规杂交育种仅仅是透过对表现型的观察来在此过程中环境等因素会引发极大选择基因型，

为探针测定了ＩＲ８及其亲本在９种限制性核酸内

切酶酶切条件下的反应，从中寻找到很多标记所

［］在染色体片段的来源。２００６年王松文等２通过

对１９个水稻品种的ＲＦＬＰ分析又以ＲＺ９０６为例进行了籼粳特异性及其序列分子生物学解析，为全面揭示水稻籼粳分化奠定了新的基础。同时对研究籼粳分化和开展籼粳品种分类研究具有方法学意义。

收稿日期：２０１１０８０８－－

，作者简介：王彤彤（男，黑龙江省哈尔滨市人，学士，１９８３－）

：研究实习员，从事水稻生物技术研究。Ｅ－ｍａｉｌａｃｉｅｒｗａｎｇ＠

。ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ

１４２

２期水稻分子标记辅助育种研究进展　　王彤彤：

２．２　ＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍＡｍｌｉｆｉｅｄＰｏｌｍｏｒＰｈｉｃ　　－ｐｙ

ＤＮＡ）ＡＰＤ是１９９０年由Ｗｉｌｌｉａｍｓ３和Ｗｅｌｓｈ４　　Ｒ

领导的２个研究小组发展起来的，建立在ＰＣＲ基

［］

［］

态性丰富等优点。李进波等利用ＩＳＳＲ和ＳＳＲ技术建立了２４个水稻温敏核不育系的ＤＮＡ指纹图谱，平均每个ＩＳＳＲ引物检测到１３．３８个多态

［３］

。王金花远远高于Ｓ性片段，ＳＲ引物的频率１

础之上的一种ＤＮＡ分子标记技术。它采用任意的非特异性单一引物，对研究对象基因组ＤＮＡ

进行Ｐ扩增产物通过电泳、染色来显示ＣＲ扩增，

［］扩增ＤＮＡ片断的多态性。２０００年李云海等５应

等利用３６个ＩＳＳＲ引物分析了３３个来源亚洲１０个国家的香稻品种的遗传多样性，获得了１８１个

１４］

。多态性片段［

此外，还有很多种分子标记技术在水稻的亲优良的农艺性状识别以及抗病抗逆缘关系鉴定、

基因指示上发挥着重要的作用。然而，各种分子

１５］

在对标记技术都不是十分完美的。陈宏等［

用ＲＡＰＤ技术对２４个籼稻不育系３个保持系和从１３个恢复系，００个ＲＡＰＤ引物中筛选出了１４

个重复性比较好的引物。它可以区分遗传背景极以此手段解决重大种子纠纷案为相近的不育系，

［］

的技术积累。２００１年刘俊峰等６在对稻瘟病

ＲＡＰＤ稳定性的研究中指出，ＤＮＡ模版的质量、

引物的选择，甚至是稳重熟练的操ＤＮＡ的浓度、

作技术才能保证ＲＡＰＤ扩增产物的重复性以及

１６］

在对抗稻飞虱的研究中，先应稳定性。武波等［

毒性研究中应用ＲＡＰＤ技术获得了一个大小

约为１且两者０００ｂＡＰＤ标记，　ｐ与基因连锁的Ｒ

［］的遗传距离为３．７ｃＭ。２００２年高东迎等７在以

之后再转成Ｓ用ＲＡＰＤ技术进行标记，ＣＡＲ（Ｓｅ－）标记大大ｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄＡｍｌｉｆｉｅｄＲｅｉｏｎ－　　ｑｐｇ

１７］

在对抗白地提高了标记的稳定性。樊颖伦等［

叶枯病基因Ｘａ２３中指出虽然ＲＦＬＰ的标记数量但是其工作量大、费用大可以区分纯合还是杂合，

高。而在ＲＦＬＰ测序后根据序列信息设计引物将ＲＦＬＰ转化成ＳＴＳ标记确实解决了这个问题。由此可见，各种分子标记技术之间的互相协作才低成本、容易操作能使水稻育种真正达到高效率、的最终目的。

）的研究中ＲＡＰＤ对抗水稻白叶枯病基因（Ｘａ２５－

获得了两个新的ＲＡＰＤ连锁标记Ｓｌ２６９和

［］

Ｓｌ３２７。２０１１年黄雯雯等８在对安徽省的３２个水稻纹枯病和立枯丝核菌的ＲＡＰＤ分析表明其ＤＮＡ的多态率高达９８．２％。２．３　ＡＦＬＰ（ＡｍｌｉｆｉｅｄＦｒａｍｅｎｔＬｅｎｔｈＰｏｌ　　　－ｐｇｇｙｍｏｒｈｉｓｍ）ｐ

［］

并于ＦＬＰ由荷兰科学家Ｖｏｓ等９人创建，　　Ａ

１９９３年获得了欧洲专利局专利，１９９５年以论文的形式发表出来。ＡＦＬＰ是在ＲＦＬＰ和ＰＣＲ的基础上发展起来的，利用了ＲＦＬＰ的可靠性和ＰＣＲ的高效性。高风华等应用ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术调查了干燥胁迫条件下全基因组转化的转录本调表明９控，０％的基因在两种稻作基因型中不受干

１０］

。姬生栋等以１旱胁迫的影响［９对引物对具有

３　借助分子标记辅助育种手段培育的水

系）稻品种（

３．１　增加产量

１８］

由国家杂交水稻工程技术研究中心［以超级稻亲本９与马来西亚普３１１为受体和轮回亲本，通野生稻杂交和连续回交，利用分子标记辅助选育成了携带野生稻增产ＱＴ择，ｌｄ１．１和Ｌ　ｙ

与自选广适性光温敏不１６３，ｌｄ２．１的新亲本Ｒｙ

育成两系杂交中稻新组合Ｙ两育系Ｙ５８Ｓ配组，

优７号，生育期限３有效穗数２５ｄ左右，２５万株·ｈ穗粒数１结实率ｍ－２，８０～２２０粒·穗－１，，千粒重２中低水肥条件下产量８０％以上，６～２９ｇ

·ｈ达９．超高产条件下产量达７５～１０．５０ｔｍ－２，·ｈ１２ｔｍ－２。并于２００８年通过了湖南省农作物

品种审定委员会的审定。

３．２　改良品质

通过分子辅助育种着重改良杂交稻的食味品

１９］

质。由浙江大学原子核农业科学研究所［培育

不同表现型的４种Ｔ５代变异株系及其对照进行结果表明，变异株系基因组较香稻１ＡＦＬＰ分析，

１１］

。近期还有很多试验证号发生了明显的变化［

明了ＡＦＬＰ技术在特异基因克隆中具有广阔

前景

）２．４　ＩＳＳＲ（ＩｎｔｅｒｓｉｍｌｅＳｅｕｅｎｃｅＲｅｅａｔ－　　ｐｑｐ

ＩＳＳＲ由加拿大蒙特利尔大学的Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｓ

１２］

等［于１９９４年提出来的。它是利用ＰＣＲ扩增

进行检测的一种Ｄ所用引物根据简单ＮＡ标记，序列重复设计而成，长度一般为１４～２０个碱基的寡核甘酸引物，用来检测两个ＳＳＲ之间的一段短稳定性高、多ＤＮＡ序列的差异。具有重复性好、

１４３

　　　　　黑　龙　江　农　业　科　学２期

的不育系浙农３Ａ于２００９年通过浙江省品种审定委员会审定，大大降低了直链淀粉含量，稻米品质得到了改良。在向明恢６３品种导入来自中国获得的改良品系，香稻的ａｌｋ和ｆｒ等位片段中，ｇ其稻米糊化温度显著降低，胶稠度升高，具有了香味，并且心白粒率得到了降低

［２０］

中筛选得到了抗白叶枯病的Ｘａ２１基因和Ｂｔ

基因。

４　展望

自２０世纪８０年代分子生物学起步经历了直到２９０年代的快速发展，１世纪分子生物学时代的飞速发展。人们可以从对植物原始的表象观察深入到分子水平的本质差异。这其中不单单激同时隐藏的巨大经发了人类与生俱来的好奇心，

济利益也是不能忽略的。转基因大豆、转基因玉米早已不是什么新鲜的话题。２００９年中国生物安全网上公布了华恢１号和Ｂｔ汕优６３两个转

。外观品质、蒸

煮食味品质得到了显著的改善。在改良特青、汕优６３等超高产品种的品质中都采用了分子标记辅助手段并且取得了良好的效果

［］２１２２－

。

３．３　提高抗病虫性

由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验

２３］

室、国家农作物分子育种中心［通过分子标记辅

助选择的方法将稻瘟病抗性基因Ｐｉ１、Ｐｉ２从供－－体ＢＬ６中回交聚合到在我国广泛应用的两系杂并筛选得到１交稻光温敏核不育系培矮６４Ｓ中，０株改良株系，既改良了该系的抗瘟性，又保存了长日低温条件下的高不育率。官化忠等

［２４］

Ｂｔ基因水稻品种获得了安全证书。至今为止通

过分子手段商业化的品种都是以转基因的方式引入外援基因，为该品种增加额外的优良性状。转基因是为物种导入外源基因，而分子标记辅助选择技术则是充分地发挥了物种内部基因多态性的将优良性状标记整合的一个过程。可以说资源，

但是随着科学、经济、法律不存在安全隐患问题，

和意识形态的发展变更，以分子标记技术整合的优良性状，培育出的完美品种是否和转基因品种一样存在专利权的问题？由于水稻很多优良性状是由多基因控制，在通过分子辅助手段整合多个大片断基因来改良水稻性状对提高水稻生产水平将起到非常重要的作用。使水稻育种进入一个由由里及表的崭新时代。也可以说是生物表及里、

它将在遗传育种的技术时代的一个光辉里程碑，历史上留下不可磨灭的印记。参考文献：

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［］３ｉｌｌｉａｍｓＪＧ，ＫｕｂｅｌｉｋＡ　Ｒ，ＬｉｖａｋＫＪ．ＤＮＡｏｌｍｏｒｈｉｓｍｓ　Ｗ　　　　　　ｐｙｐ

ｂａｒｂｉｔｒａｒａｒｅｕｓｅｆｕｌａｓｍａｒａｍｌｉｆｉｅｄｒｉｍｅｒｓｅｎｅｔｉｃ　　　　　　－ｐｙｙｐｇ　　］，１：ｋｅｒｓ［Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃｃｉｄｓｅｓｅａｒｃｈ９９０，１８（２２）　Ａ　Ｒ６５３１６５３５．－

［］，４ｅｌｓｈＪＭｃｃｌｅｌｌａｎｄＭ　Ｏ．Ｆｉｎｅｒｒｉｎｔｉｎｅｎｏｍｅｓｕｓｉｎ　Ｗ　　－　ｇｐｇｇｇ　

，ＰＣＲｗｉｔｈａｒｂｉｔｒａｒＪ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈｒｉｍｅｒｓ［　　　　ｙｐ　（）：１９９０，１８２４７２１３７２１８．－

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］（）：遗传相关研究［生物学报，Ｊ．２０００，２６２１７１１７６．－［］董宁，侯占军．稻瘟菌对水稻品种梅雨明的无毒性６　刘俊峰，

］：植物病理学报，的遗传分析和分子标记［Ｊ．２００１，３１（１）１０１５．－

［］向阳海，孙立华，等．抗水稻白叶枯病新基因７　高东迎，

（）］：的ＲＡ中国水稻科学，Ｘａ２５ｔＰＤ分析［Ｊ．２００２，１６（２）－

利用与

Ｐｉ９紧密连锁的分子标记ＳＲＭ２２为选择标记，－

也成功地将水稻品系７５１１２７中的稻瘟病抗性－－基因Ｐ显ｉ９导入优质水稻雄性不育系金山Ｂ１，－－著提高了该不育系对稻瘟病的抗性。李仕贵等

［２５］

）利用与稻瘟病抗性基因Ｐ紧密连锁的ｉｄ（ｔ－

）分子标记ＲＭ２６２对含有稻瘟病抗性基因Ｐｉｄ（ｔ－的地方品种地谷与江南香糯及８９８７的Ｆ２群体进

［６］行辅助选择，选择准确率达９８％以上。Ｌｉｕ等２

利用Ｐｉ１的连锁标记对珍汕９７Ｂ进行稻瘟病抗－获得１珍汕９近等基性改良，７株含Ｐｉ１的“７Ｂ”－因系纯合株系。陈学伟等利用该技术将３个抗稻）瘟病基因Ｐｉｄ（ｔ１、Ｐｉｂ、Ｐｉｔａ２聚合到优良保持－－－

［７］

。Ｈ系冈４６Ｂ２ｉｔｔａｍａｎｉ等将稻瘟病抗性基因

Ｐｉ５、Ｐｉ１和Ｐｉｔａ聚合到同一品系ＢＬ１２４中。－－－

倪大虎等利用分子标记辅助选择技术将白叶枯病抗性基因Ｘａ２１和稻瘟病抗性基因Ｐｉ９聚合到－同一水稻品系，获得了同时高抗稻瘟病和白叶枯

２８］２９］

。陈英之等［病的稳定株系［对来源于普通野

生稻的５个抗稻褐飞虱（基因通过杂交、回ＢＰＨ）转育和聚合Ｂ交和分子标记辅助选择，ＰＨ抗性基因到杂交水稻亲本中，获得了与抗ＢＰＨ基因紧密或较紧密连锁的Ｓ成功地获得ＳＲ分子标记，５个杂交水稻亲本抗性基因聚合系。其苗期和成

［０］

株期表现对Ｂ利用分子ＰＨ高抗性。杨子贤等３标记辅助选择改良９３１１恢复系对白叶枯病和螟－虫的抗性取得了良好的效果。在回交的后代家系１４４

２期

１７９１８１．－

水稻分子标记辅助育种研究进展　　王彤彤：

１４１７．－

［］付新民，高冠军，等．分子标记辅助选择改良优质水２０　王岩，

］稻恢复系明恢６分子植物育种，３的稻米品质［Ｊ．２００９，（）：７４６６１６６５．－

［］蔡秀玲，李钱峰，等．分子标记辅助选择改良特青２１　刘巧泉，

］作物学报，及其杂交稻米的蒸煮与食味品质［Ｊ．２００６，（）：３２１６４６９．－

［］分子标记辅助渗入佳辐占基因组约８２２０Ｏｋｂ区间　江良荣．

］分子植物育种，定向改良珍汕９７Ｂ外观品质［Ｊ．２００４，（）：２３４５３４５４．－

［］李信，晏斌，等．利用分子标记辅助选择改良培矮２３　董巍，

：分子植物育种，６４Ｓ的稻瘟病抗性［Ｊ］．２０１０，８（５）８５３８６０．－

［］陈志伟，潘润森，等．通过标记辅助回交育种改良２４　官华忠，

］优质水稻保持系金山Ｂ分子植物育１的稻瘟病抗性［Ｊ．－（）：种，２００６，４１４９５３．－

［］王玉平，黎汉云，等．利用微卫星鉴定水稻的稻瘟２５　李仕贵，

］（）：病抗性［生物工程学报，Ｊ．２０００，１６３３２４３２７．－

［］，，２６ＩＵＳｈｉｉｎＬＩＸｉｎ，ＷＡＮＧＣｈａｏａｎｅｔａｌ．Ｉｍｒｏｖｅ　Ｌ　　　　－ｐｇｙｇｐ

ｍｅｎｔｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｒｉｃｅｂｌａｓｔｉｎＺｈｅｎｓｈａｎ９７ｂｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　　　　　　ｙ　，ａｉｄｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｃｔａＢｏｔａｎｉｃａＳｉｎｉｃａ２００３，ｍａｒｋｅｒ　　　　）：４５（１１１３４６１３５０．－

［］）李仕贵，马玉清，等．水稻抗稻瘟病基因Ｐ２７ｉｄ（ｔ１、　陈学伟，－

］生物工程学报，Ｐｉｂ、Ｐｉｔａ２的聚合及分子标记选择［Ｊ．－－（）：２００４，２０５７０８７１４．－

［］易成新，李莉，等．利用分子标记辅助选择聚合水２８　倪大虎，

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，ｆｉｎｅｒＪ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９９５，２３：ｒｉｎｔｉｎ　　　ｇｐｇ［４４０７４４１４．－

［］张洪亮，王海光，等．应用ｃ１０ＤＮＡ－ＡＦＬＰ比较干燥　高凤华，

］胁迫条件下水稻和旱稻转录本表达图谱［科学通报，Ｊ．（）：２００９，５４１６２３０５２３１９．－

［］陈鹏，焦浈，等．１１ＴＦＬＰ分析　姬生栋，５代水稻变异株系的Ａ

］（）：和特异片段序列分析［河南农业科学，Ｊ．２００９４２２２５．－

［］１２ｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚＥ，ＲａｆａｌｓｋｉＡ，ＬａｂｕｄａＤ．Ｇｅｎｏｍｅｆｉｎｅｒｒｉｎｔ　Ｚ　　　　－ｇｐ

ｉｎｂｓｉｍｌｅｓｅｕｅｎｃｅｒｅｅａｔ（ＳＳＲ）ａｎｃｈｏｒｅｄｏｌｍｅｒａｓｅ　　－　ｇｙｐｑｐｐｙ　　

，ｒｅａｃｔｉｏｎａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１９９４，２０：ｃｈａｉｎ　　ｐ１７６１８３．－

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］栽培香稻品种的遗传多样性［分子植物育种，Ｊ．２００５，（）：３１３７４２．－

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］（）：讨［西北农林科技大学学报，Ｊ．２００３，３１５１３９１４１．－

［］韦东，欧倩．水稻抗褐稻飞虱基因Ｓ１６ＣＡＲ标记的获　武波，

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］作物学报，ＲＦＬＰ标记定位及其ＳＴＳ标记转化［Ｊ．２００６，（）：３２６９３１９３５．－

［］庄文，熊跃东，等．导入野生稻增产ＱＴ１８Ｌ育成优质高　吴俊，

］：产杂交稻新组合Ｙ两优７号［杂交水稻，Ｊ．２０１０，２５（４）２０２２．－

［］赵霏，任三娟，等．具中等直链淀粉含量的籼型优１９　周屹峰，

］：质不育系浙农３杂交水稻，Ａ的选育［Ｊ．２０１０，２５（４）

ＰｒｏｒｅｓｓｏｆＲｉｃｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＭａｋｅｒＡｓｓｉｓｔｅｄＳｅｌｅｃｔｉｏｎ　　　　－　ｇ

ＷＡＮＧＴｏｎｔｏｎ　－ｇｇ

（，ＣｒｏＴｉｌｌａｅａｎｄＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅｉｌｏｎｉａｎＡｃａｄｅｍｏｆＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　　　　　　ｐｇｇｊｇｙｇ　　　

，）ＨａｒｂｉｎＨｅｉｌｏｎｉａｎ１５００８６ｇｊｇ　

：，ＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｔｅｃｔｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｉｎｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｔｈｅｍｅｒｉｔｏｆｍｏｌｅｃｕ　　　　　　　－　　　　　　　－ｐｇｌａｒｍａｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｃｏｍａｒｉｎｗｉｔｈｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｂｒｅｅｄｉｎｗａｓａｎａｌｚｅｄ．ＦｏｕｒＣｏｍｍｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　－　　　　　　　ｐｇｇｙ　　

ｍａｒｋｅｒｔｅｃｈｎｉｕｅｓ（ＲＦＬＰ，ＲＡＰＤ，ＡＦＬＰａｎｄＩＳＳＲ）ｈａｄｂｅｅｎｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｃｌｕｄｉｎｔｈｅｉｒａｄｖａｎｔａｅｓａｎｄ　　　　　　　　ｑｇｇ　，ｓｈｏｒｔｃｏｍｉｎｓ．Ｉｎｔｈｅｍｅａｎｔｉｍｅｔｈｅａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｏｆｃｕｌｔｉｖａｒｓａｎｄｌｉｎｅｓｂｒｅｄｏｒｉｍｒｏｖｅｄｂｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｋｅｒａｓ　　　　　　　　　　　　　－－ｇｐｙ　

，，ｉｅｌｄｕａｌｉｔｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｏｎｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｉｎｓｅｃｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．　　　　　　　　　ｙｑｙ：；；；Ｋｅｗｏｒｄｓｒｉｃｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｖａｒｉｅｔｉｅｓｉｍｒｏｖｅｍｅｎｔｓｉｔｕａｔｉｏｎ　－　　ｐｙ　

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（）：黑龙江农业科学２０１２２１４２～１４５

ＨｅｉｌｏｎｉａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　ｇｊｇｇ水稻分子标记辅助育种研究进展

王彤彤

（）黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所，黑龙江哈尔滨１５００８６

摘要：为充分挖掘水稻分子标记辅助育种的潜质，分析了分子辅助育种较常规育种方法的优点，常用的分子辅助育种技术（及优点和不足，同时阐述了通过分子标记辅助选择育种方法培育ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、ＩＳＳＲ）品质以及抗病虫性等成果。或改良现有水稻品种的产量、

关键词：水稻；分子辅助育种；品种改良；现状

（）中图分类号：Ｓ５１１．０３５．３　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００２２７６７２０１２０２０１４２０４－－－

其稳定的产量，　　水稻作为中国粮食作物之首，

是保证国家粮食安全的重要指标之一。自改革开放以来，城市化建设的成绩是有目共睹的，然而所带来的问题也层出不穷，农业可以说是受到影响最大的，气象灾害频发、耕地面积下降、环境污染农村人口骤然减少，都成为了国家粮食安全加剧、

的隐患，所以提高单产，有效地利用有限的耕地、人力、生物等资源，实为第二次绿色革命的根本宗旨。转基因技术可以说是人类现代史的一个里程碑，然而，社会各界对其安全性始终表示怀疑，虽然欧美很多国家已经允许转基因农业产品在有效但更多国家依然保持的监管控制下商业化运营，

观望态度。如何将新型的生物技术更加有效又十分安全地应用到育种上去成为了新的课题。分子标记辅助育种（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｂｒｅｅｄ　　　－）即有这种潜质。ｉｎｇ

的误差，而且是完全不能避免的。而借助分子标是直接对基因型进行选择，不但精准记辅助手段，

而且效率高。植物大多数的农艺性状都是由多个基因联合调控的，所以单纯的常规育种在针对数量性状的选择上已经达到了瓶颈。

１．３　分子标记辅助育种不存在安全隐患

因为在整个育种过程当中完全不需要引入外源基因。与转基因育种有本质的区别。这项技术是将极大地发挥了种群内部遗传多态性的优势，种群内部优良性状整合的一个过程。

１．４　分子标记辅助育种是直接在ＤＮＡ水平上

选择差异它能够根据ＮＡ遗传变异的直接反映，　　是Ｄ

植物体的各个时期进行选择，不受环境及表达的限制，数量多，多态性高，并且遗传稳定。

２　几种常用的分子辅助技术

２．１　ＲＦＬＰ（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｍｅｎｔＬｅｎｔｈＰｏｌ　　　－ｇｇｙ

ｍｏｒｈｉｓｍ）ｐＦＬＰ是Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等于１９８０年提出的分子　　Ｒ

生物学最早的遗传标记技术。它指的是基因型之间限制性片断长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或者点突变引

［］起的。１９９４年沈革志等１利用２８个ＲＦＬＰ标记

１　分子标记辅助育种技术的四大优点

１．１　针对质量性状的选择

常规杂交育种通过对其表现型常年多次重复的观察是可以获得其纯合植株的。但周期一般要七八年甚至是十多年。在常规育种的基础上借助分子技术的辅助手段可以将质量性状准确地定位，大大地降低了回交的次数，也缩减了所需要的年限。

１．２　针对数量性状的选择

常规杂交育种仅仅是透过对表现型的观察来在此过程中环境等因素会引发极大选择基因型，

为探针测定了ＩＲ８及其亲本在９种限制性核酸内

切酶酶切条件下的反应，从中寻找到很多标记所

［］在染色体片段的来源。２００６年王松文等２通过

对１９个水稻品种的ＲＦＬＰ分析又以ＲＺ９０６为例进行了籼粳特异性及其序列分子生物学解析，为全面揭示水稻籼粳分化奠定了新的基础。同时对研究籼粳分化和开展籼粳品种分类研究具有方法学意义。

收稿日期：２０１１０８０８－－

，作者简介：王彤彤（男，黑龙江省哈尔滨市人，学士，１９８３－）

：研究实习员，从事水稻生物技术研究。Ｅ－ｍａｉｌａｃｉｅｒｗａｎｇ＠

。ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ

１４２

２期水稻分子标记辅助育种研究进展　　王彤彤：

２．２　ＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍＡｍｌｉｆｉｅｄＰｏｌｍｏｒＰｈｉｃ　　－ｐｙ

ＤＮＡ）ＡＰＤ是１９９０年由Ｗｉｌｌｉａｍｓ３和Ｗｅｌｓｈ４　　Ｒ

领导的２个研究小组发展起来的，建立在ＰＣＲ基

［］

［］

态性丰富等优点。李进波等利用ＩＳＳＲ和ＳＳＲ技术建立了２４个水稻温敏核不育系的ＤＮＡ指纹图谱，平均每个ＩＳＳＲ引物检测到１３．３８个多态

［３］

。王金花远远高于Ｓ性片段，ＳＲ引物的频率１

础之上的一种ＤＮＡ分子标记技术。它采用任意的非特异性单一引物，对研究对象基因组ＤＮＡ

进行Ｐ扩增产物通过电泳、染色来显示ＣＲ扩增，

［］扩增ＤＮＡ片断的多态性。２０００年李云海等５应

等利用３６个ＩＳＳＲ引物分析了３３个来源亚洲１０个国家的香稻品种的遗传多样性，获得了１８１个

１４］

。多态性片段［

此外，还有很多种分子标记技术在水稻的亲优良的农艺性状识别以及抗病抗逆缘关系鉴定、

基因指示上发挥着重要的作用。然而，各种分子

１５］

在对标记技术都不是十分完美的。陈宏等［

用ＲＡＰＤ技术对２４个籼稻不育系３个保持系和从１３个恢复系，００个ＲＡＰＤ引物中筛选出了１４

个重复性比较好的引物。它可以区分遗传背景极以此手段解决重大种子纠纷案为相近的不育系，

［］

的技术积累。２００１年刘俊峰等６在对稻瘟病

ＲＡＰＤ稳定性的研究中指出，ＤＮＡ模版的质量、

引物的选择，甚至是稳重熟练的操ＤＮＡ的浓度、

作技术才能保证ＲＡＰＤ扩增产物的重复性以及

１６］

在对抗稻飞虱的研究中，先应稳定性。武波等［

毒性研究中应用ＲＡＰＤ技术获得了一个大小

约为１且两者０００ｂＡＰＤ标记，　ｐ与基因连锁的Ｒ

［］的遗传距离为３．７ｃＭ。２００２年高东迎等７在以

之后再转成Ｓ用ＲＡＰＤ技术进行标记，ＣＡＲ（Ｓｅ－）标记大大ｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄＡｍｌｉｆｉｅｄＲｅｉｏｎ－　　ｑｐｇ

１７］

在对抗白地提高了标记的稳定性。樊颖伦等［

叶枯病基因Ｘａ２３中指出虽然ＲＦＬＰ的标记数量但是其工作量大、费用大可以区分纯合还是杂合，

高。而在ＲＦＬＰ测序后根据序列信息设计引物将ＲＦＬＰ转化成ＳＴＳ标记确实解决了这个问题。由此可见，各种分子标记技术之间的互相协作才低成本、容易操作能使水稻育种真正达到高效率、的最终目的。

）的研究中ＲＡＰＤ对抗水稻白叶枯病基因（Ｘａ２５－

获得了两个新的ＲＡＰＤ连锁标记Ｓｌ２６９和

［］

Ｓｌ３２７。２０１１年黄雯雯等８在对安徽省的３２个水稻纹枯病和立枯丝核菌的ＲＡＰＤ分析表明其ＤＮＡ的多态率高达９８．２％。２．３　ＡＦＬＰ（ＡｍｌｉｆｉｅｄＦｒａｍｅｎｔＬｅｎｔｈＰｏｌ　　　－ｐｇｇｙｍｏｒｈｉｓｍ）ｐ

［］

并于ＦＬＰ由荷兰科学家Ｖｏｓ等９人创建，　　Ａ

１９９３年获得了欧洲专利局专利，１９９５年以论文的形式发表出来。ＡＦＬＰ是在ＲＦＬＰ和ＰＣＲ的基础上发展起来的，利用了ＲＦＬＰ的可靠性和ＰＣＲ的高效性。高风华等应用ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术调查了干燥胁迫条件下全基因组转化的转录本调表明９控，０％的基因在两种稻作基因型中不受干

１０］

。姬生栋等以１旱胁迫的影响［９对引物对具有

３　借助分子标记辅助育种手段培育的水

系）稻品种（

３．１　增加产量

１８］

由国家杂交水稻工程技术研究中心［以超级稻亲本９与马来西亚普３１１为受体和轮回亲本，通野生稻杂交和连续回交，利用分子标记辅助选育成了携带野生稻增产ＱＴ择，ｌｄ１．１和Ｌ　ｙ

与自选广适性光温敏不１６３，ｌｄ２．１的新亲本Ｒｙ

育成两系杂交中稻新组合Ｙ两育系Ｙ５８Ｓ配组，

优７号，生育期限３有效穗数２５ｄ左右，２５万株·ｈ穗粒数１结实率ｍ－２，８０～２２０粒·穗－１，，千粒重２中低水肥条件下产量８０％以上，６～２９ｇ

·ｈ达９．超高产条件下产量达７５～１０．５０ｔｍ－２，·ｈ１２ｔｍ－２。并于２００８年通过了湖南省农作物

品种审定委员会的审定。

３．２　改良品质

通过分子辅助育种着重改良杂交稻的食味品

１９］

质。由浙江大学原子核农业科学研究所［培育

不同表现型的４种Ｔ５代变异株系及其对照进行结果表明，变异株系基因组较香稻１ＡＦＬＰ分析，

１１］

。近期还有很多试验证号发生了明显的变化［

明了ＡＦＬＰ技术在特异基因克隆中具有广阔

前景

）２．４　ＩＳＳＲ（ＩｎｔｅｒｓｉｍｌｅＳｅｕｅｎｃｅＲｅｅａｔ－　　ｐｑｐ

ＩＳＳＲ由加拿大蒙特利尔大学的Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｓ

１２］

等［于１９９４年提出来的。它是利用ＰＣＲ扩增

进行检测的一种Ｄ所用引物根据简单ＮＡ标记，序列重复设计而成，长度一般为１４～２０个碱基的寡核甘酸引物，用来检测两个ＳＳＲ之间的一段短稳定性高、多ＤＮＡ序列的差异。具有重复性好、

１４３

　　　　　黑　龙　江　农　业　科　学２期

的不育系浙农３Ａ于２００９年通过浙江省品种审定委员会审定，大大降低了直链淀粉含量，稻米品质得到了改良。在向明恢６３品种导入来自中国获得的改良品系，香稻的ａｌｋ和ｆｒ等位片段中，ｇ其稻米糊化温度显著降低，胶稠度升高，具有了香味，并且心白粒率得到了降低

［２０］

中筛选得到了抗白叶枯病的Ｘａ２１基因和Ｂｔ

基因。

４　展望

自２０世纪８０年代分子生物学起步经历了直到２９０年代的快速发展，１世纪分子生物学时代的飞速发展。人们可以从对植物原始的表象观察深入到分子水平的本质差异。这其中不单单激同时隐藏的巨大经发了人类与生俱来的好奇心，

济利益也是不能忽略的。转基因大豆、转基因玉米早已不是什么新鲜的话题。２００９年中国生物安全网上公布了华恢１号和Ｂｔ汕优６３两个转

。外观品质、蒸

煮食味品质得到了显著的改善。在改良特青、汕优６３等超高产品种的品质中都采用了分子标记辅助手段并且取得了良好的效果

［］２１２２－

。

３．３　提高抗病虫性

由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验

２３］

室、国家农作物分子育种中心［通过分子标记辅

助选择的方法将稻瘟病抗性基因Ｐｉ１、Ｐｉ２从供－－体ＢＬ６中回交聚合到在我国广泛应用的两系杂并筛选得到１交稻光温敏核不育系培矮６４Ｓ中，０株改良株系，既改良了该系的抗瘟性，又保存了长日低温条件下的高不育率。官化忠等

［２４］

Ｂｔ基因水稻品种获得了安全证书。至今为止通

过分子手段商业化的品种都是以转基因的方式引入外援基因，为该品种增加额外的优良性状。转基因是为物种导入外源基因，而分子标记辅助选择技术则是充分地发挥了物种内部基因多态性的将优良性状标记整合的一个过程。可以说资源，

但是随着科学、经济、法律不存在安全隐患问题，

和意识形态的发展变更，以分子标记技术整合的优良性状，培育出的完美品种是否和转基因品种一样存在专利权的问题？由于水稻很多优良性状是由多基因控制，在通过分子辅助手段整合多个大片断基因来改良水稻性状对提高水稻生产水平将起到非常重要的作用。使水稻育种进入一个由由里及表的崭新时代。也可以说是生物表及里、

它将在遗传育种的技术时代的一个光辉里程碑，历史上留下不可磨灭的印记。参考文献：

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ｂａｒｂｉｔｒａｒａｒｅｕｓｅｆｕｌａｓｍａｒａｍｌｉｆｉｅｄｒｉｍｅｒｓｅｎｅｔｉｃ　　　　　　－ｐｙｙｐｇ　　］，１：ｋｅｒｓ［Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃｃｉｄｓｅｓｅａｒｃｈ９９０，１８（２２）　Ａ　Ｒ６５３１６５３５．－

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］（）：遗传相关研究［生物学报，Ｊ．２０００，２６２１７１１７６．－［］董宁，侯占军．稻瘟菌对水稻品种梅雨明的无毒性６　刘俊峰，

］：植物病理学报，的遗传分析和分子标记［Ｊ．２００１，３１（１）１０１５．－

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（）］：的ＲＡ中国水稻科学，Ｘａ２５ｔＰＤ分析［Ｊ．２００２，１６（２）－

利用与

Ｐｉ９紧密连锁的分子标记ＳＲＭ２２为选择标记，－

也成功地将水稻品系７５１１２７中的稻瘟病抗性－－基因Ｐ显ｉ９导入优质水稻雄性不育系金山Ｂ１，－－著提高了该不育系对稻瘟病的抗性。李仕贵等

［２５］

）利用与稻瘟病抗性基因Ｐ紧密连锁的ｉｄ（ｔ－

）分子标记ＲＭ２６２对含有稻瘟病抗性基因Ｐｉｄ（ｔ－的地方品种地谷与江南香糯及８９８７的Ｆ２群体进

［６］行辅助选择，选择准确率达９８％以上。Ｌｉｕ等２

利用Ｐｉ１的连锁标记对珍汕９７Ｂ进行稻瘟病抗－获得１珍汕９近等基性改良，７株含Ｐｉ１的“７Ｂ”－因系纯合株系。陈学伟等利用该技术将３个抗稻）瘟病基因Ｐｉｄ（ｔ１、Ｐｉｂ、Ｐｉｔａ２聚合到优良保持－－－

［７］

。Ｈ系冈４６Ｂ２ｉｔｔａｍａｎｉ等将稻瘟病抗性基因

Ｐｉ５、Ｐｉ１和Ｐｉｔａ聚合到同一品系ＢＬ１２４中。－－－

倪大虎等利用分子标记辅助选择技术将白叶枯病抗性基因Ｘａ２１和稻瘟病抗性基因Ｐｉ９聚合到－同一水稻品系，获得了同时高抗稻瘟病和白叶枯

２８］２９］

。陈英之等［病的稳定株系［对来源于普通野

生稻的５个抗稻褐飞虱（基因通过杂交、回ＢＰＨ）转育和聚合Ｂ交和分子标记辅助选择，ＰＨ抗性基因到杂交水稻亲本中，获得了与抗ＢＰＨ基因紧密或较紧密连锁的Ｓ成功地获得ＳＲ分子标记，５个杂交水稻亲本抗性基因聚合系。其苗期和成

［０］

株期表现对Ｂ利用分子ＰＨ高抗性。杨子贤等３标记辅助选择改良９３１１恢复系对白叶枯病和螟－虫的抗性取得了良好的效果。在回交的后代家系１４４

２期

１７９１８１．－

水稻分子标记辅助育种研究进展　　王彤彤：

１４１７．－

［］付新民，高冠军，等．分子标记辅助选择改良优质水２０　王岩，

］稻恢复系明恢６分子植物育种，３的稻米品质［Ｊ．２００９，（）：７４６６１６６５．－

［］蔡秀玲，李钱峰，等．分子标记辅助选择改良特青２１　刘巧泉，

］作物学报，及其杂交稻米的蒸煮与食味品质［Ｊ．２００６，（）：３２１６４６９．－

［］分子标记辅助渗入佳辐占基因组约８２２０Ｏｋｂ区间　江良荣．

］分子植物育种，定向改良珍汕９７Ｂ外观品质［Ｊ．２００４，（）：２３４５３４５４．－

［］李信，晏斌，等．利用分子标记辅助选择改良培矮２３　董巍，

：分子植物育种，６４Ｓ的稻瘟病抗性［Ｊ］．２０１０，８（５）８５３８６０．－

［］陈志伟，潘润森，等．通过标记辅助回交育种改良２４　官华忠，

］优质水稻保持系金山Ｂ分子植物育１的稻瘟病抗性［Ｊ．－（）：种，２００６，４１４９５３．－

［］王玉平，黎汉云，等．利用微卫星鉴定水稻的稻瘟２５　李仕贵，

］（）：病抗性［生物工程学报，Ｊ．２０００，１６３３２４３２７．－

［］，，２６ＩＵＳｈｉｉｎＬＩＸｉｎ，ＷＡＮＧＣｈａｏａｎｅｔａｌ．Ｉｍｒｏｖｅ　Ｌ　　　　－ｐｇｙｇｐ

ｍｅｎｔｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｒｉｃｅｂｌａｓｔｉｎＺｈｅｎｓｈａｎ９７ｂｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　　　　　　ｙ　，ａｉｄｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｃｔａＢｏｔａｎｉｃａＳｉｎｉｃａ２００３，ｍａｒｋｅｒ　　　　）：４５（１１１３４６１３５０．－

［］）李仕贵，马玉清，等．水稻抗稻瘟病基因Ｐ２７ｉｄ（ｔ１、　陈学伟，－

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ｉｎｂｓｉｍｌｅｓｅｕｅｎｃｅｒｅｅａｔ（ＳＳＲ）ａｎｃｈｏｒｅｄｏｌｍｅｒａｓｅ　　－　ｇｙｐｑｐｐｙ　　

，ｒｅａｃｔｉｏｎａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１９９４，２０：ｃｈａｉｎ　　ｐ１７６１８３．－

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］：质不育系浙农３杂交水稻，Ａ的选育［Ｊ．２０１０，２５（４）

ＰｒｏｒｅｓｓｏｆＲｉｃｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＭａｋｅｒＡｓｓｉｓｔｅｄＳｅｌｅｃｔｉｏｎ　　　　－　ｇ

ＷＡＮＧＴｏｎｔｏｎ　－ｇｇ

（，ＣｒｏＴｉｌｌａｅａｎｄＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅｉｌｏｎｉａｎＡｃａｄｅｍｏｆＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　　　　　　ｐｇｇｊｇｙｇ　　　

，）ＨａｒｂｉｎＨｅｉｌｏｎｉａｎ１５００８６ｇｊｇ　

：，ＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｔｅｃｔｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｉｎｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｔｈｅｍｅｒｉｔｏｆｍｏｌｅｃｕ　　　　　　　－　　　　　　　－ｐｇｌａｒｍａｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｃｏｍａｒｉｎｗｉｔｈｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｂｒｅｅｄｉｎｗａｓａｎａｌｚｅｄ．ＦｏｕｒＣｏｍｍｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　－　　　　　　　ｐｇｇｙ　　

ｍａｒｋｅｒｔｅｃｈｎｉｕｅｓ（ＲＦＬＰ，ＲＡＰＤ，ＡＦＬＰａｎｄＩＳＳＲ）ｈａｄｂｅｅｎｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｃｌｕｄｉｎｔｈｅｉｒａｄｖａｎｔａｅｓａｎｄ　　　　　　　　ｑｇｇ　，ｓｈｏｒｔｃｏｍｉｎｓ．Ｉｎｔｈｅｍｅａｎｔｉｍｅｔｈｅａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｏｆｃｕｌｔｉｖａｒｓａｎｄｌｉｎｅｓｂｒｅｄｏｒｉｍｒｏｖｅｄｂｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｋｅｒａｓ　　　　　　　　　　　　　－－ｇｐｙ　

，，ｉｅｌｄｕａｌｉｔｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｏｎｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｉｎｓｅｃｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．　　　　　　　　　ｙｑｙ：；；；Ｋｅｗｏｒｄｓｒｉｃｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｖａｒｉｅｔｉｅｓｉｍｒｏｖｅｍｅｎｔｓｉｔｕａｔｉｏｎ　－　　ｐｙ　

檪檪檪殏

檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏

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