实验四 植物DNA 的提取
一、实验目的
掌握CTAB 法从植物叶片提取DNA 的原理和方法。采用CTAB 法从植物叶片中提取基因组DNA ，并进行纯度分析。
二、实验原理
1、核酸提取的基本原理
核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
在浓氯化钠溶液(1～2 mol ／L) 中，DNA 核蛋白的溶解度很大，RNA 核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol ／L) 中，DNA 核蛋白的溶解度很小，RNA 核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA 核蛋白和RNA 核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA 溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA 钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA 。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA 。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA 溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA 沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA 核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA 制品。为了彻底除去DNA 制品中混杂的RNA ，可用RNA 酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。
在DNA 提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH 值4.0～11.0间较稳定，pH 值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA 分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA 分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA 分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右) 下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS 和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。
2、CTAB 法和SDS 法的提取原理
（1）CTAB 法是一种快速简便的提取植物总DNA 的方法. 。CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子型去污剂，它不仅能使蛋白质变性，而且还能与核酸形成特异的核酸-CTAB 复合物，这种复合物溶于高盐缓冲液（≥0.7M NaCl ），降低盐浓度，通过超速离心能选择性地沉淀核酸，并与多糖等可溶性杂质分开，CTAB-核酸复合物再用70-75%乙醇浸泡可脱掉CTAB 。提取时先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB 分离缓冲液，将DNA 溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后通过异丙醇沉淀或低盐离心得到DNA 。
（2）SDS 法也是提取植物DNA 的常用方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁，然后加入SDS 使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc 可使SDS —蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全。
3、DNA 的浓度测定和纯度分析
（1）定磷法：是对样品中核酸（DNA 和RNA ）含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝，在660nm 处有最大光吸收。
（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm 。1ug/mL的DNA 溶液A 260=0.020，1ug/mL的RNA 溶液或单链DNA 的A 260=0.022~0.024。1个A 260相当于50ug/mL的DNA 、40ug/mL的RNA 。蛋白质的最大吸收在280nm ，多糖的最大吸收在230nm 。纯的DNA 的A 260/A280在1.8左右，纯的RNA 的A 260/A280在2.0左右。
三、试剂和器材：
(1) 1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸馏水，用浓HCl 调至pH8.0以蒸馏水定容至1000ml
(2) CTAB 分离缓冲液： 2g CTAB ，8.18g NaCL ，0.74g EDTA.Na 2.2H 2O ，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL 巯基乙醇，加水定容到100mL 。
(3) 洗涤缓冲液（70%乙醇，10mmol/L乙酸铵）：70mL 无水乙醇，0.077g 乙酸铵，加水到100mL 。
(4) TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA
(5) 氯仿:异戊醇=24:1
(6) 液氮
(7) 研钵，恒温水浴（37～100℃），离心机，离心管。
四、操作方法：
(1) 将10mlCTAB 分离缓冲液加入50ml 离心管中，置于65℃水浴中预热。
(2) 称取1.5g 叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。
(3) 取1g 粉末直接加入预热的CTAB 分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。
(4) 样品于65℃保温30分钟，每5～10分钟混匀一次。
(5) 加等体积（10ml ）的氯仿－异戊醇，轻轻颠倒混匀。
(6) 室温下4000r/min离心10分钟。
(7) 用胶头滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中（注意不要吸动悬浮的细胞碎片和中
间白色的蛋白质层），向离心管中加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使DNA 析出。（有些情况下，这一步可以产生云雾状的DNA 析出，如果看不到云雾状的DNA ，样品则可以在冰浴中放置数小时甚至过夜）。
(8) 用下述方法收集DNA ：
如果呈云雾状的DNA 析出，则用玻璃棒在云雾状的DNA 中轻轻转动，缠起DNA ，然后将玻璃棒转移至20mL 洗涤缓冲液中浸泡洗涤10分钟（不要将DNA 沉淀从玻璃棒上弄掉）。
如果看不到云雾状的DNA ，可将离心管在4000r/min离心5分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL 洗涤缓冲液，轻轻转动离心管，洗涤核酸沉淀10分钟，然后离心，小心地倒掉上清液，让DNA 沉淀自然干燥20分钟。
(9) 用玻璃棒缠出DNA ，在室温下使DNA 自然干燥20分钟。
(10) 将自然干燥的DNA 溶于1mL TE 缓冲液中，—20℃保存备用。
(11) 取100uL 稀释20倍，测定A 260，A 280，A 230，或作出吸收波谱200~400nm并计算浓
度和得率。
(12) 取5~10uLDNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA 的大小和质量，以λ-DNA/Hind
Ⅲ做分子量标准，另取5uL 做限制性酶切。
注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。
五、思考题
1、 CTAB 、EDTA 、巯基乙醇的作用是什么？
2、 吸取样品、抽提、及电泳时应注意什么？为什么？
实验四 植物DNA 的提取
一、实验目的
掌握CTAB 法从植物叶片提取DNA 的原理和方法。采用CTAB 法从植物叶片中提取基因组DNA ，并进行纯度分析。
二、实验原理
1、核酸提取的基本原理
核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
在浓氯化钠溶液(1～2 mol ／L) 中，DNA 核蛋白的溶解度很大，RNA 核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol ／L) 中，DNA 核蛋白的溶解度很小，RNA 核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA 核蛋白和RNA 核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA 溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA 钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA 。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA 。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA 溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA 沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA 核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA 制品。为了彻底除去DNA 制品中混杂的RNA ，可用RNA 酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。
在DNA 提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH 值4.0～11.0间较稳定，pH 值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA 分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA 分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA 分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右) 下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS 和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。
2、CTAB 法和SDS 法的提取原理
（1）CTAB 法是一种快速简便的提取植物总DNA 的方法. 。CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子型去污剂，它不仅能使蛋白质变性，而且还能与核酸形成特异的核酸-CTAB 复合物，这种复合物溶于高盐缓冲液（≥0.7M NaCl ），降低盐浓度，通过超速离心能选择性地沉淀核酸，并与多糖等可溶性杂质分开，CTAB-核酸复合物再用70-75%乙醇浸泡可脱掉CTAB 。提取时先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB 分离缓冲液，将DNA 溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后通过异丙醇沉淀或低盐离心得到DNA 。
（2）SDS 法也是提取植物DNA 的常用方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁，然后加入SDS 使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc 可使SDS —蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全。
3、DNA 的浓度测定和纯度分析
（1）定磷法：是对样品中核酸（DNA 和RNA ）含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝，在660nm 处有最大光吸收。
（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm 。1ug/mL的DNA 溶液A 260=0.020，1ug/mL的RNA 溶液或单链DNA 的A 260=0.022~0.024。1个A 260相当于50ug/mL的DNA 、40ug/mL的RNA 。蛋白质的最大吸收在280nm ，多糖的最大吸收在230nm 。纯的DNA 的A 260/A280在1.8左右，纯的RNA 的A 260/A280在2.0左右。
三、试剂和器材：
(1) 1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸馏水，用浓HCl 调至pH8.0以蒸馏水定容至1000ml
(2) CTAB 分离缓冲液： 2g CTAB ，8.18g NaCL ，0.74g EDTA.Na 2.2H 2O ，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL 巯基乙醇，加水定容到100mL 。
(3) 洗涤缓冲液（70%乙醇，10mmol/L乙酸铵）：70mL 无水乙醇，0.077g 乙酸铵，加水到100mL 。
(4) TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA
(5) 氯仿:异戊醇=24:1
(6) 液氮
(7) 研钵，恒温水浴（37～100℃），离心机，离心管。
四、操作方法：
(1) 将10mlCTAB 分离缓冲液加入50ml 离心管中，置于65℃水浴中预热。
(2) 称取1.5g 叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。
(3) 取1g 粉末直接加入预热的CTAB 分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。
(4) 样品于65℃保温30分钟，每5～10分钟混匀一次。
(5) 加等体积（10ml ）的氯仿－异戊醇，轻轻颠倒混匀。
(6) 室温下4000r/min离心10分钟。
(7) 用胶头滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中（注意不要吸动悬浮的细胞碎片和中
间白色的蛋白质层），向离心管中加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使DNA 析出。（有些情况下，这一步可以产生云雾状的DNA 析出，如果看不到云雾状的DNA ，样品则可以在冰浴中放置数小时甚至过夜）。
(8) 用下述方法收集DNA ：
如果呈云雾状的DNA 析出，则用玻璃棒在云雾状的DNA 中轻轻转动，缠起DNA ，然后将玻璃棒转移至20mL 洗涤缓冲液中浸泡洗涤10分钟（不要将DNA 沉淀从玻璃棒上弄掉）。
如果看不到云雾状的DNA ，可将离心管在4000r/min离心5分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL 洗涤缓冲液，轻轻转动离心管，洗涤核酸沉淀10分钟，然后离心，小心地倒掉上清液，让DNA 沉淀自然干燥20分钟。
(9) 用玻璃棒缠出DNA ，在室温下使DNA 自然干燥20分钟。
(10) 将自然干燥的DNA 溶于1mL TE 缓冲液中，—20℃保存备用。
(11) 取100uL 稀释20倍，测定A 260，A 280，A 230，或作出吸收波谱200~400nm并计算浓
度和得率。
(12) 取5~10uLDNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA 的大小和质量，以λ-DNA/Hind
Ⅲ做分子量标准，另取5uL 做限制性酶切。
注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。
五、思考题
1、 CTAB 、EDTA 、巯基乙醇的作用是什么？
2、 吸取样品、抽提、及电泳时应注意什么？为什么？